Produire et purifier une protéine est incontestablement un art. En effet, chaque protéine possède des caractéristiques / particularités bien précises qui font de sa production et sa purification de véritables défis à relever.
Il va de soi que la pureté et l’activité sont les deux mots magiques pour un biochimiste. Mais quels sont les trucs et astuces à connaître qui s’avèrent indispensables pour l’obtention une protéine pure et fonctionnelle ?
Les clefs pour produire une protéine fonctionnelle…
Un des enjeux majeurs est de produire une protéine dans sa conformation native et, par conséquent, avec un repliement adéquat. Il est évident que bien connaître sa protéine d’intérêt est un atout majeur. Aussi, une étude de faisabilité par bio-informatique facilite le design du processus idéal à suivre. Cela inclut la détermination du nombre de ponts disulfures, l’identification de sites de glycosylations, l’obtention des probabilités de solubilité et stabilité, l’analyse des structures secondaires et tertiaires prédictives… En somme, cela apporte des informations plus que précieuses pour mener à bien la purification d’une protéine.
Ainsi, un projet qui a toutes ses chances de réussir commence toujours par une analyse approfondie ce qui permet la sélection du système de production adéquat, comme par exemple :
– l’emploi de souches bactériennes capables de former des ponts disulfures dans leur cytoplasme ou de produire des protéines toxiques ou instables
– l’emploi de cellules humaines afin de produire des protéines fonctionnelles le plus proche de l’in vivo grâce aux modifications post-traductionnelles, comme les glycosylations, et à la présence de protéines chaperon adéquates.
La pureté, toujours plus de pureté…
La purification de protéines n’est pas chose aisée et les résines proposées sont diverses et variées. Les plus usitées sont les résines :
– d’affinité (purification via le tag ou via une interaction avec un partenaire)
– échangeuses d’ions (purification grâce à la charge de la protéine)
– hydrophobes (purification grâce à l’hydrophobicité de la protéine)
– tamis moléculaires ou Gel filtration (purification grâce à la taille de la protéine)
Dans le cas de protéines non-taguées ou difficilement purifiables, la conception de stratégies de purification innovantes est essentielle. En effet, l’optimisation de cette étape en termes de coûts et de temps en minimisant le nombre d’étapes, mais aussi d’efficacité est indispensable.
Ainsi, l’emploi de résines telles que les résines « mixed mode » ou les résines sur lesquelles sont couplées à façon les cibles des protéines d’intérêt est privilégié. Ceci permet, en effet, d’éviter la multiplication des étapes de purification, le risque potentiel de perte de matériel purifié par précipitation, ainsi que le temps dévolu aux expériences. Certes, cela nécessite des mises au point qui peuvent s’avérer aisément mises en place si un « DoE » ou design des expériences est, au préalable, bien pensé et établi.
Mais l’histoire ne s’arrête pas là…
Après obtention d’une protéine aussi pure que souhaitée, l’histoire n’est toutefois pas finie et il ne faut en aucun cas négliger les contrôles qualité, comme par exemple un Western Blot, un test d’activité, une caractérisation des interactions protéine -protéine (ex : Tests Elisa, ITC, « Cell based assays »…) et/ou une mesure des taux d’endotoxines.
tebu-bio met à disposition des outils et experts capables de donner les clefs de la réussite de projets complexes en proposant des services incluant des études allant de la biologie moléculaire à la biologie cellulaire en passant par la biochimie des protéines. Aussi, n’hésitez pas à nous lancer de nouveaux défis…
Envie d’en savoir plus…
tebu-bio présentera un mode d’emploi afin de sous-traiter la production et la purification de protéines à Biopharma Outsourcing vol3 B4B-Connection des 9 et 10 octobre 2017 à Toulouse